特此，IGC组委有幸在9月8日至9月9日北京第七届免疫基因及细胞治疗大会前邀请到中国医学科学院血液学研究所、特聘研究员张孝兵教授，分享他在iPSC以及基因治疗领域最新的进展与思考。
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张孝兵，中国医学科学院血液学研究所，特聘研究员
张孝兵，博士生导师，细胞生态海河实验室领军科学家，美国罗马琳达大学兼职副教授。1999年毕业于华东理工大学获得博士学位，同年赴香港中文大学开展造血干细胞研究工作。2002-2009年在美国Fred Hutchinson肿瘤研究中心从事基因治疗研究工作。2009年受聘于罗马琳达大学任助理教授、副教授。自2014年开始，张孝兵教授受聘为实验血液学国家重点实验室兼职研究员。2022年入选国家高层次人才计划。在细胞与基因治疗领域深耕30年，发表学术论文100篇，共获20项中美发明专利。他开发的Episomal重编程载体和基因编辑的双切HDR载体已经被全球数百家实验室和公司所采用。近期，他的团队在血友病A的AAV和LNP治疗策略上取得了重要进展，即将进入临床试验阶段。此外，团队还在慢病毒、AAV和CRISPR的临床安全性上进行了深入研究，这包括开发了一种新的方法来定量检测慢病毒和AAV的整合位点、质粒和病毒载体的全序列测定以及全流程监测，并创新了一种高效方法来检测体外和体内的CRISPR基因编辑的脱靶事件。
IGC组委：
iPSC重编程技术在临床上可以进行个性化治疗、药物筛选、配合基因编辑进行基因治疗，在科研方面可以作为疾病模型构建的基础。但同时iPSC重编程也存在一定的局限性。从您的角度，您认为iPSC重编程领域中当下最应突破的是哪些方向？iPSC重编程发展前景又如何呢？
张孝兵教授：
细胞治疗领域在iPSC技术的驱动下已经步入了一个新的里程碑。理论上，iPSC具有无限的扩增潜力和可分化为众多组织器官细胞的能力，这为细胞治疗和药物研发带来了新的希望。但如您所提及，实际应用中，iPSC仍面临诸多挑战，如细胞的异质性、表观遗传异常与记忆，这些都限制了其广泛应用的潜能。
多年来，我和我的团队一直致力于使用Episomal Plasmid（表位质粒）系统对血细胞进行重编程，努力创制高质量的诱导多能干细胞。这些表位质粒独特地在细胞中独立于染色体DNA进行复制，避免了整合入宿主基因组的风险，因此能够在一定程度上降低插入突变的威胁。
近期，邓宏魁教授的团队在化学重编程方面取得了引人注目的进展，为细胞命运转换开辟了一条不依赖外源基因的新路径。这种化学重编程技术，虽然理论上避免了使用可能导致致癌风险的基因，但它的长期安全性和对DNA的潜在影响仍需深入研究。
对于iPSC的异质性，我们确信，通过高超的实验技巧与精准的细胞筛选是关键。细胞的培养经验尤为重要，因为即便是同源的iPSC细胞，在不同实验室的培养环境中，短时间内就可能展现出显著的差异性。这强调了操作的精准性以及细胞培养经验的重要性。
关于表观遗传异常和记忆的问题，我们正在探索挑选和培育高质量iPSC克隆的策略。我们预期，如果能够控制重编程因子的表达量和持续时间，有可能减少表观遗传异常和记忆的风险。
总结而言，iPSC重编程领域的前景仍然广阔，但也面临一系列挑战。我的团队将继续努力，希望能够为该领域做出更多贡献，并为细胞治疗与药物研发开辟新的途径。
IGC组委：
iPSC能够按需定向分化成不同细胞，成为干细胞领域中的热门研究领域之一。但是iPSC的应用仍存在一定的弊端例如分化难度高、致瘤性等。通过引入CRISPR技术则可以在一定程度上弥补这类缺陷，想请您谈谈CRISPR-Cas9基因编辑技术是通过何种方式来提升iPSC的效用和降低危险性的？
张孝兵教授：
首先，我们来思考一下iPSC技术的起源和挑战。标准的iPSC被定义为，当它们被注射入免疫缺陷的小鼠体内时，能够形成畸胎瘤。这一定义自然而然地引发了关于iPSC衍生产品在人体中的成瘤性与致瘤性问题的担忧。不过，如果我们转换思维，不再仅仅局限于寻求一种全能的细胞，而是制备具备特定分化潜能的多能干细胞方向发展，这样的细胞在特定的条件下有更强的定向分化潜能，而对其他胚层细胞的分化潜能较弱，这种方式可能会为我们带来既不会形成畸胎瘤，又能在标准iPSC培养条件下稳定扩增和传代的干细胞。
为了实现这一目标，CRISPR-Cas9技术正好为我们提供了一个强大的工具。理论上，我们可以通过这项技术精准编辑关键的干性因子，并同时引入组织特异性转录因子。CRISPR-Cas9的高精度基因编辑能力为我们打开了一扇创新之门。我们预测，经过精确的基因编辑后，iPSC在特定的培养条件下，不仅能够维持其干性、并实现无限的扩增和传代，同时，当环境条件发生改变时，这些细胞还能自发地进行预期的分化，从而为我们提供所需的功能细胞。
进一步来说，通过CRISPR-Cas9技术，我们可以深入到基因水平，打开细胞发育的“开关”，促使细胞快速而高效地分化为目标细胞，同时也可通过“关闭”某些基因，从而降低或完全避免细胞的致瘤风险。这意味着，我们不仅可以提高细胞分化的效率，而且可以确保所获得的细胞产品在应用到疾病治疗中时是安全的。
综上所述，CRISPR-Cas9技术为iPSC的进一步优化和应用提供了巨大的潜力，我们应充分挖掘这一技术的潜力，带给干细胞治疗领域新的机会和挑战。
IGC组委：
您和团队最近实现了新的突破——利用一个episomal载体将血细胞重编程为iPSC，您认为相比于其他重编程方式，这项技术具备了怎样的独特优势？以及希望您谈谈在如此多种的基因编辑技术中，您和团队为何选择了基于HDR的基因编辑技术？
张孝兵教授：
确实，我们团队采用基于EBNA1-oriP系统的episomal载体取得了一系列成果。该系统的独特之处在于，它能使质粒在哺乳动物细胞中以表位的方式相对稳定地存在。几年前，我们通过4个episomal载体高效地表达了Yamanaka因子—OCT4、SOX2、KLF4和MYC，同时增加了抗凋亡及效率增强因子BCL-XL，从而成功地将成人外周血细胞重编程为iPSC。令人兴奋的是，我们从仅仅1ml的血样中获得了高达1000个的iPSC克隆。不过，同时运用多个质粒显然较为繁琐，对于满足GMP标准的质控也带来了挑战。为此，我们最近采用了一个载体来表达多个相关基因，短至1-2周即可实现高效的重编程，这大大简化了整个过程。
对比其他重编程方式，比如Sendai病毒（SeV）方法，虽然SeV提供了一个相对安全的方式，因为它不会整合入宿主基因组，从而避免了潜在的基因突变和致瘤风险，但该方法的成本较高，并且可能面临知识产权方面的挑战。因此，我们认为基于episomal载体的方法更具优越性。
至于为何选择基于HDR的基因编辑技术，这与技术的效率和适用性有关。尽管近年来碱基编辑BE和引导编辑PE得到了快速发展，并在碱基替代或引入微小的Indel（删插突变）上表现出色，但当涉及到大片段插入时，这些技术的效率往往不尽如人意。例如，即使是如TwinPE这样的新型技术，其效率也相对较低。相反，我们使用HDR技术，通过双切模板和小分子化合物抑制NHEJ修复途径，实现了在iPSC中4-5kb大片段的插入效率达到了50%以上，这显著简化了iPSC的单克隆筛选过程。
总的来说，基于我们的研究需求和技术特点，以上所述的技术选择为我们提供了更高效、更安全的解决方案。我们坚信，这些技术的进一步研究和应用将为干细胞治疗领域带来更多的机遇。
IGC组委：
CRISPR/Cas9将基因编辑技术抬到了新的高度，但是基因编辑工具的“脱靶效应”导致的副作用也十分严重包括引发癌症等。在这种情况下，基因编辑的安全性检测就显得尤为重要，想请您谈谈在安全性检测领域内，有什么您认为颇具潜力的技术？您和团队在此方向又进行了哪些努力呢？
张孝兵教授：
确实，CRISPR/Cas9的技术革命不仅为基因编辑带来了光明的前景，同时也引发了对于编辑准确性和安全性的深入关注。其中，脱靶效应无疑是我们面临的最大挑战之一。事实上，当一个细胞内的两个不同位置都被编辑时，存在的染色体易位的风险是不能被忽视的。这不仅可能导致脱靶位点的微小变异，更有可能与靶位点发生染色体重排，从而导致更为严重的安全隐患。
当我们谈论脱靶效应的检测，GUIDE-seq无疑是目前最为主流的方法，其能为我们提供真实的脱靶位置，避免了误导性的数据，但其成本较高且精度有限。鉴于此，我们团队投入大量的精力进行技术优化，最终开发了OliTag-seq。这种方法不仅显著提高了检测精度，还大大降低了检测成本。并且，我们还在深入研究其他类似技术，以捕捉在体和离体的各种CRISPR-Cas脱靶事件。
至于基于慢病毒载体的基因治疗，其带来的插入突变和致癌风险也让我们十分关切。目前虽然有众多方法可以检测慢病毒载体的插入位点，但真正能够精确定量的技术还十分有限。我们团队针对这一挑战，研发出了一种新的定量分析方法，其灵敏度之高可以轻松捕捉到丰度为0.01%的插入事件，这大大增加了我们对于潜在安全隐患的早期预警和处理时间。
此外，我们高度重视载体的质量控制。利用纳米孔测序和共识序列分析，我们达到了超过99.9%的检测准确度，并成功鉴别出低至0.1%的污染或明显突变的载体。这一技术相对于现有的标准测序方法，无疑将质量控制提升到了一个全新的高度。通过对载体生产全过程的监控，我们能够及时识别出任何微小的问题，避免大规模损失和安全事故的发生。
另一方面，针对AAV载体，我们发现其内部可能存在大量不完整的基因组。通过对AAV载体的全序列测定，我们可以为其设计提供更为精准的信息，以期获得更高质量的产品。
虽然目前的监管框架尚未强制要求进行上述检测，但我们深知，只有持续提高产品的质量和安全性，才能够为业界和患者建立起更为坚实的信任。我们团队致力于推动这一领域的持续发展，并与数据分析专家携手，期待为业界同行带来更多的价值。
IGC组委：非常感谢张教授的精彩分享！敬请期待张教授在IGC会议现场带来更多精彩分享！